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TB Green® Premix Ex Taq™ (Tli RNaseH Plus) |
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应用Thermal Cycler Dice Real Time System III and Lite扩增仪的操作方法 |
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1. 按下列组份配制PCR反应液(反应液配制请在冰上进行)。 |
试剂 |
使用量 |
终浓度 |
TB Green Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)(2X) |
12.5 μl |
1X |
PCR Forward Primer(10 μM) |
0.5 μl |
0.2 μM*1 |
PCR Reverse Primer(10 μM) |
0.5 μl |
0.2 μM*1 |
DNA模板(<100 ng)*2 |
2 μl |
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灭菌水 |
9.5 μl |
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Total |
25 μl*3 |
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*1 通常引物终浓度为0.2 μM可以得到较好结果。反应性能较差时,可以在0.1~1.0 μM范围内调整引物浓度。
*2 DNA模板的添加量通常在100 ng以下。因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同,必要时可进行梯度稀释,确定合适的DNA模板添加量。另外,2 Step RT-PCR反应的cDNA(RT反应液)作为模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。
*3 建议反应液体积为25 μl。 |
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2. 进行Real Time PCR反应。 |
建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序。由于使用Tm值较低的引物等原因,两步法PCR反应扩增性能较差时,可以尝试进行三步法PCR扩增反应。有关PCR的具体反应条件请参照「实验条件的选择」。 |
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两步法PCR扩增标准程序: |
Stage 1:预变性 |
Repeat:1 |
95℃ 30秒 |
Stage 2:PCR反应 |
Repeat:40 |
95℃ 5秒 |
60℃ 30秒 |
Stage 3:Dissociation |
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◆特别提示:
本制品中使用的TaKaRa Ex Taq HS是利用抗Taq抗体的Hot Start用DNA聚合酶,与其他公司的化学修饰型Hot Start用DNA聚合酶相比,不需要PCR反应前的95℃、5~15分钟的酶的活性化反应。如果高温处理时间过长,会使酶的活性下降,其PCR的扩增效率、定量准确度等都会受到影响。如果在PCR反应前进行模板的预变性,通常设定为95℃、30秒。
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3. 实验结果分析。 |
反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线,进行PCR定量时制作标准曲线等。分析方法参见仪器的操作手册。 |