引物设计是决定PCR反应成败的最重要因素。引物设计有两个主要考虑因素：特异性和扩增效率。
· 特异性是由错配的频率决定的。特异性差的引物易产生不需要的扩增产物。
· 扩增效率是指引物以每循环增加两倍扩增产物达到理论最优的能力。
下表提供了引物设计的指南。

引物Tm值用来评价DNA-DNA杂交链稳定性。了解Tm值对于确定适当的退火温度是至关重要的。过高的退火温度会导致引物-模板杂交不足，导致PCR产物产率低。退火温度过低可能导致非特异性产物扩增。
低于20个碱基的引物Tm值的计算，可以使用如下Wallace法则：
Tm = 2℃ (A+T) + 4℃ (G+C)
超过20个碱基的引物Tm值的计算，我们推荐使用免费的引物设计软件，比如Primer3。

可以不考虑Inosine碱基，使用A、G、C、T计算Tm值就可以。

有影响。简并数量应尽量少。
通常一条引物中简并的碱基不要超过4处，如果简并的碱基数过多，则会造成反应体系中有效引物的量相对减少，此时应适当增加引物的使用量。但引物量过大，容易引起非特异扩增，应加以注意。

每种引物的最终浓度应在0.1至0.5 μM之间。每种引物的工作液浓度通常为10-20 μM。
· 小于10 kb的PCR扩增，0.2 μM的引物终浓度即可产生令人满意的结果。
· 使用TaKaRa LA Taq DNA polymerases 或者TaKaRa Ex Taq DNA polymerases扩增长片段(～17 kb)，可将引物终浓度提高到1 μM。
· Advantage 2 DNA polymerases 和 Titanium Taq DNA polymerases等高收量聚合酶，推荐的引物终浓度为0.4 μM。
过高的引物浓度会增加错配的可能，这可能导致非特异性扩增。过低的引物浓度则可能导致扩增效率低。

标准脱盐引物对大多数PCR应用的效果是比较令人满意的。

最适模板添加量取决于模板的复杂程度和目的基因拷贝数。25-30圈循环，可以检测到大约10⁴拷贝的目的基因序列。
· 通常1 μg的人类基因组DNA含有3.04 x 10⁵ 个DNA分子。对于大多数PCR反应来说，30-100 ng的人基因组DNA就足够了。高拷贝的目的序列，如管家基因，只需要10 ng的模板。复杂度较高的模板添加量范围在10 ng至500 ng之间。
· 通常1 μg大肠杆菌基因组DNA含有2 x 10⁸ 个DNA分子；因此，模板的推荐量在100 pg和1 ng之间。
· 通常1 μg的λDNA含有1.9 x 10¹⁰ 分子DNA；因此，模板添加量可以少至100 pg。
· cDNA模板的数量取决于目的序列的拷贝数。cDNA添加量通常用等效RNA添加量。PCR反应中cDNA的含量可以低至10 pg (RNA当量)。
值得注意的是，并非所有的聚合酶都能耐受过量的模板。对于含有过量模板（高达1 μg）的样品，我们建议使用 PrimeSTAR GXL DNA Polymerase。

模板质量：
DNA完整性对于长片段的扩增至关重要。DNA损伤（例如在DNA纯化过程中DNA断裂，或者在高温和低pH下DNA脱嘌呤）导致产生大量不完整扩增产物，降低总产量。DNA损伤也可以在酸性条件下发生。因此，避免用水重悬DNA模板，DNA在pH 7-8或缓冲溶液中最稳定。

PCR条件
· 变性时间应保持在最低限度，以减少脱嘌呤。
· 使用touchdown PCR;在较高的退火温度下开始，持续几个循环以后，每循环减少2℃退火温度。
· 设计Tm值高于68℃的引物。

PCR酶

我们提供几种适用于长链PCR的聚合酶。可以根据GC含量和扩增片段大小来灵活选择 TaKaRa LA Taq DNA polymerase, TaKaRa LA Taq Polymerase with GC Buffer, 和 PrimeSTAR GXL DNA Polymerase。

GC含量在不同基因组中各不相同。GC含量超过65%的模板被认为是GC-rich模板。基因组中富含GC的区域主要集中在调控区域，包括启动子、增强子和顺式调控元件。富含GC的区域容易形成反向重复，或发夹结构，使PCR退火过程不能顺利进行。因此，因为两条DNA链分离效率低的原因，GC-rich模板的扩增比较困难，这也导致了由于聚合酶延伸过早终止而导致的扩增片段不完整。

PCR反应条件

· 使用较高的变性温度(例如98℃，而不是94℃或95℃)以允许模板完全变性。
· 尽量缩短GC-rich模板的退火时间。
· 使用Tm值较高的引物(>68℃)，因为退火可以在较高的温度下进行。

PCR聚合酶
使用经过优化后适用于扩增GC-rich序列的聚合酶。如何选择合适的PCR聚合酶，请参考官网“PCR Enzyme的选择”。

我们从客户那里了解到，使用PrimeSTAR MAX DNA Polymerase 或CloneAmp HiFi PCR Premix，通过向反应中添加DMSO，可以提高GC-rich模板的扩增效果。DMSO的推荐浓度在2.5%到5%之间。

有些模板可能有很长的AT-rich延伸序列，在标准反应条件下很难扩增。如恶性疟原虫基因组中AT约占80%，其侧翼基因区往往富含AT。
推荐用于GC-rich模板的聚合酶，如EmeraldAmp^® GT PCR Master Mix, EmeraldAmp^® MAX PCR Master Mix和 PrimeSTAR GXL DNA Polymerase等，也适用于AT-rich模板扩增。
使用AT-rich模板的优点是可以使用较低的延伸温度。对于某些含量为80-5% AT的模板，延伸温度可以从72℃降低到65-60℃。在这种降低的温度下，DNA复制似乎是可靠的(Su et al. 1996)。

■ 参考文献
Su, X. Z., et al. Reduced Extension Temperatures Required for PCR Amplification of Extremely A+T-rich DNA. Nucl Acids Res. 24, 1574-1575 (1996).

镁离子是热稳定DNA聚合酶所必需的辅助因子，对成功扩增具有重要意义。如果没有足够的游离Mg²⁺，PCR聚合酶的活性会降低。相反，过量的游离Mg²⁺会降低酶的保真度，并可能增加非特异性扩增。许多因素可以影响反应中游离Mg²⁺的数量，包括DNA模板浓度、样品中的螯合剂(如EDTA或柠檬酸盐)、dNTP浓度以及蛋白质的存在。
· 某些聚合酶(如TaKaRa Ex Taq DNA polymerases和TaKaRa LA Taq DNA polymerases)配有不含镁离子的反应缓冲液和单独的25 mM MgCl2。对于这些酶，你可以优化每个反应的Mg²⁺浓度。
· Titanium Taq DNA polymerases和Advantage 2 DNA polymerases是镁离子耐受性聚合酶，其缓冲液中含有3.5 mM的MgCl2。
· PrimeSTAR GXL DNA Polymerase和PrimeSTAR MAX DNA Polymerase反应的Mg²⁺最终浓度为1 mM；该浓度增加了这些酶的保真度

成功的PCR需要DNA双链在变性过程中分离，引物退火至变性DNA。盐能中和DNA磷酸盐骨架上的负电荷，通过抵消相互排斥的负电荷来稳定双链DNA。氯化钾(KCl)通常用于PCR扩增，终浓度为50 mM。为了提高DNA片段扩增效果，特别是100-1,000 bp片段的扩增，建议KCl浓度为70-100 mM。对于长片段的扩增，较低的盐浓度似乎更有效，而短片段的扩增则以较高的盐浓度为佳。这种效应可能是因为高盐浓度优先允许短链DNA而不是长链DNA变性。
值得注意的是，盐浓度超过50 mM会抑制Taq聚合酶活性。

最初的变性步骤
有时需要预热使复杂模板变性(例如基因组DNA)；94℃1分钟足以使其变性。过度热处理可能会导致酶失活。
· 用于直接PCR扩增而不需要DNA提取纯化的MightyAmp^™ DNA Polymerase Ver.3，需要在98℃预热2 min
· 对于TaKaRa LA Taq DNA polymerases和Advantage GC 2 DNA polymerases，需要一个初始变性步骤
· PrimeSTAR酶不需要预热来激活酶

变性条件
应根据您所使用的热循环仪来选择变性条件。通常使用94-95℃，30秒或98℃，10秒。
如果使用耐热酶，如PrimeSTAR系列聚合酶中的一种，我们建议使用短时间和高温的变性步骤。（例如98℃，5-10秒）
温度过高或变性时间过长可能会导致酶活性丧失和/或长模板的损伤。

退火条件
退火步骤应针对每对引物进行调整；退火温度直接取决于引物的Tm值。使用过低的退火温度可能导致错配和非特异性扩增，从而导致目的产物收率较低。
根据引物Tm调节退火温度或进行两步PCR均可提高扩增效率和特异性。
· 对于Taq酶，推荐退火时间为30秒。
· PrimeSTAR系列酶具有良好的priming效率。因此，使用5 - 15秒的短退火时间是非常重要的。过长的退火时间可能会导致错配--诱导的非特异性扩增。
· 当扩增小于1 kb的短链时，推荐使用三步法PCR。对于富含GC的序列或长片段扩增(>10 kb)，推荐采用两步法PCR。

延伸步骤
一般来说，建议延伸时间为1 min/kb。当使用高速酶如SpeedSTAR HS DNA Polymerase或者SapphireAmp Fast PCR Master Mix时，对于扩增产物的反应速率为10 sec/kb。（即对于1 kb的产物，延伸时间为10 sec。对于2 kb的产物，延伸时间是20 sec，等等）。
PrimeSTAR Max DNA Polymerase和PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 包含特别的延伸因子，允许在5-20 sec/kb下进行高速反应。如果将这些酶与含有过量模板的样品一起使用，则应使用1 min/kb的延伸时间。

三步法PCR包括变性、退火和延伸步骤。当引物的Tm值低于延伸温度或小于68℃时，推荐使用这种方法。
如果引物Tm值接近延伸温度（72℃）或稍低一些，考虑使用两步法PCR，包括变性步骤和合并的退火/延伸步骤。该方法的退火温度不应超过延伸温度。

两步法PCR扩增较长的模板(>4 kb)时，最好选择68℃的延伸温度。这种较低的延伸温度通过降低影响扩增的脱嘌呤速率，显著提高了较长的扩增产物的产量。
当进行三步法PCR时，应使用72℃作为延伸温度，用于扩增短片段（<4 kb）。

聚合酶应储存在-20℃的无霜冰箱中（可接受范围在-15℃到-23℃之间）。不建议在-70℃或-80℃下长期储存（超过一周）。酶不可以在室温下保存。
在打开一管新酶之前，简单离心以集液于管底。

冻干的PCR预混物密封在原袋中，应在室温（20-22℃）下储存。任何未使用的产品也应储存在室温下(20-22℃)，放在原来的袋子中用干燥剂重新密封，或者放在干燥器里。

为避免污染，操作时应戴手套，手指远离Tube管口。每次从原液管中取酶时，必须使用一个新的、干净的枪头。
当从原管中吸取酶时，将枪头的末端置于液体中合适的位置，使其能刚好获得所需的酶量。枪头的尖端不应完全浸入酶溶液中，因为尖端的外部会被酶粘附，从而妨碍了准确量取并且会浪费酶。
注意: 枪头对不同类型溶液的吸附性不同。当液体不止一次被吸出时，枪头尖端就会失去其准确度。低保留量枪头尖端推荐用于粘性溶液，如含有甘油的溶液。

DNA聚合酶的保真度指的是它能够准确复制模板，或者在引物的3'端加入正确的核苷酸。碱基错配的比率被称为错配率。具有校正活性的PCR聚合酶具有3'→ 5'外切酶活性，可切除不正确的核苷酸并将其替换为正确的核苷酸。
高保真酶被推荐用于基因克隆、蛋白质表达、蛋白质结构功能研究、cDNA文库构建和下一代测序。可参考官网PCR Enzyme的选择，选择适合的高保真酶。

由于测量保真度的方法不同，生产商提供的聚合酶错配率并不总是可以直接比较的。这些方法包括：
1. 蓝白斑筛选
该方法以表型变化为基础，因其快速、相对简单、经济有效而得到广泛应用。蓝白斑筛选的原始方法，被称为Kunkel方法（Kunkel和Tindall，1987），是基于lacZ基因的α-互补性，它能还原β-半乳糖苷酶基因活性，并产生蓝色菌落。使用此方法，来自含有单核苷酸错配或移码突变的lacZα PCR产物的菌落通常呈白色，而由无错误扩增子衍生的克隆则产生蓝色菌落。
2. 测序的方法
该方法是对PCR后单个菌落进行Sanger测序。蓝白斑筛选法可以快速测定聚合酶的保真度，但不如测序法准确。蓝白斑筛选法检测不到不影响翻译的单核苷酸突变。而测序方法可以检测到所有的突变，因此更加准确。

■ 参考文献
Kunkel, T. A. and Tindall, K. R., Fidelity of DNA synthesis by the Thermus aquaticus DNA polymerase. Biochemistry27, 6008-6013 (1987).

PrimeSTAR系列的保真性是对PCR后单个菌落进行Sanger测序后确定的，如下所示：
· 以GC-rich易发生碱基突变的Thermus thermophilus HB8基因组DNA为模板，任意选择10个区域进行PCR扩增。
· 将PCR产物克隆到质粒载体上。
· 为每个扩增产物选择多个克隆，并对PCR插入片段进行测序。
PrimeSTAR Max DNA Polymerase的保真度是Taq聚合酶的29倍， PrimeSTAR GXL DNA Polymerase的保真度是Taq聚合酶的6.5倍。

所有用于多重PCR的引物对应该对其目标DNA序列有相似的priming效率。这可以通过使用相近的最佳退火温度的引物来实现。
在设计引物时，要特别注意以下参数：
· 与目标核酸序列的同源性
· 长度
· GC含量
· 浓度
· 引物同源性(引物内部或彼此之间不应具有同源性，特别是在3'端)

巢式PCR是一种通过重复扩增提高PCR结果的方法。巢式PCR需要设计一个新的正向嵌套（FN）或反向嵌套（RN）引物，该引物位于原始引物内部，可以与原始引物配对。少量的初级PCR产物被用作嵌套引物的PCR模板。
巢式PCR通常通过以下方式提高所需PCR产物的产量：
· 消除初级PCR中可能存在的非特异性条带
· 增强在最初的PCR中可能很弱或不可见的特异性条带
需要注意的是，在巢式PCR中，只应该使用非常少量的初级产品作为模板，因为该模板的序列复杂度非常低。首先，将原PCR产物按照1:100稀释，取1 μl稀释液作为巢式PCR的模板。此外，可能需要将循环圈数减少到25-30圈。巢式PCR的最佳反应条件应根据经验确定。

在PCR变性过程中，所有的DNA分子都会变成单链。退火温度降低时，可形成三种类型的双链：
· 同源双链--互补链退火
· 异源双链--可能具有部分同源性的同源序列的杂交
· 引物和模板形成的双链
为了获得更高的特异性，在最初的PCR反应周期中，应通过增加严格性（即增加温度）来减少异源双链的形成。Touchdown PCR通过使用逐渐降低退火温度的反应条件来增加特异性。初始退火温度设置比引物预估Tm值高几度。在后续循环中，退火温度逐渐降低，直至达到引物的计算退火温度(Don 1991)。通过在最初的PCR周期中使用更高的退火温度，touchdown PCR有助于积累引物-模板互补程度最高的序列，从而富集了最特异的扩增子。在随后的循环中转换到较低的温度会降低严格性，用已经富集的特异性模板改善priming条件。我们建议在较高的退火温度下执行5 - 10个初始循环，然后逐渐降低温度，直至最佳退火温度或者"touchdown 温度"。例如，如果引物的Tm值为68℃，则推荐的TD-PCR退火温度为：
· 72℃，5个循环
· 70℃，5个循环
· 68℃，>25个循环

■ 参考文献
Don, R. H., et al. 'Touchdown' PCR to circumvent spurious priming during gene amplification. Nucl Acids Res. 19(14):4008 (1991).

如果PCR产物由高保真聚合酶扩增获得，产生平滑末端，可以使用Taq聚合酶加A尾。下面提供了向PCR产物3’端加A尾的简要流程：
1. 纯化PCR产物。在添加A尾之前，用PCR纯化试剂盒或苯酚抽提和DNA沉淀的方法对PCR产物进行纯化，去除反应中所有的聚合酶是非常重要的。这一步至关重要，因为任何残留的DNA聚合酶的校正活性都会降解A尾，从而重新生成平滑末端。
2. 制备Taq DNA聚合酶反应混合物：

*当使用特定量的PCR产物时，加A尾反应最有效。建议用量为： PCR产物10-100 ng/100 bp，即相当于0.15-1.5 pmol PCR产物(见下表)。

3. 在72℃孵育20分钟
继续进行TA克隆。为了获得最佳的连接效率，最好使用新鲜的PCR产物，因为在储存过程中，3’端A尾会逐渐消失。

干扰PCR扩增的杂质称为PCR抑制剂。PCR抑制剂存在于多种样品类型中，可能导致PCR敏感性下降，甚至导致PCR结果假阴性。PCR抑制剂可能有无机物和有机物两种来源(Schrader 2012)。

无机PCR抑制剂包括
· 钙或其他金属离子，会与镁离子竞争
· EDTA会与镁离子结合，降低其浓度

一些有机PCR抑制剂包括：
· 多糖和类似核酸结构的糖脂，会干扰引物与模板的结合
· 黑色素和胶原蛋白，能与DNA聚合酶形成可逆复合物
· 与模板DNA和聚合酶相互作用的腐植酸，即使在低浓度下也能阻止酶反应
· 尿素可能会导致聚合酶的降解

其他可以抑制PCR的有机化合物包括：
· 血液、血清或血浆样本中的血红蛋白、乳铁蛋白和IgG
· 抗凝血剂，如肝素
· 植物来源的多酚、果胶和木聚糖
· 乙醇、异丙醇、苯酚或洗涤剂，如SDS
如果模板制备中存在抑制剂，将起始模板进行100倍稀释，可以充分稀释抑制剂并允许扩增。或者，可能需要对模板进行乙醇沉淀来解决这个问题。

■ 参考文献
Schrader, C., et al. PCR inhibitors—occurrence, properties and removal. J Appl Microbiol. 113:1014-1026 (2012).

PCR过度循环是指循环超过扩增的指数阶段。当PCR过程中存在以下情况时，即发生过度循环：
· 底物耗竭(dNTPs或引物)
· 试剂（dNTPs或酶）在变性温度下不再稳定
· PCR聚合酶受到产物(焦磷酸盐、双链DNA)的抑制
· 非特异性产物对试剂(dNTPs和引物)的竞争
· 反应的pH值降低
· 产物在高浓度下的不完全变性/链分离
在琼脂糖凝胶上检测时，PCR过度循环的标志是强烈的拖尾，条带难以区分。通常建议进行预试验，以确定生产足够产物所需的最少PCR循环圈数。如果产物产量每3～5个循环显著增加，则PCR产物仍处于指数扩增阶段。我们发现，过度循环的cDNA不能为任何下游应用提供合适的模板。

PCR聚合酶可以引入不同类型的突变，包括单碱基替换、缺失和插入。碱基替换通常是由DNA合成过程中不正确的dNTP的错误插入引起的。
聚合酶可以在一个或多个核苷酸丢失或插入的位置产生突变。这种突变的频率可能与序列有关，在高重复序列中可能更高。最常见的突变是单核苷酸缺失，这可能是由于模板与引物在一个重复的同源序列中不匹配导致的。当聚合酶终止在一条DNA链上的合成，并在互补链上发生启动后继续合成时，DNA重排也会发生(例如strand-switching或者jumping PCR)。这种突变发生在不同的DNA区域有高度同源性的情况下。反应中过多的DNA模板也可能促进这种类型的突变。

以下因素可导致PCR引入突变：

不平衡的dNTP浓度
不等量的四种dNTPs浓度可以增加8倍的碱基替换可能。
· 高的酶浓度
· 长时间孵育
· 缺少3'→5'外切酶活性

    镁离子浓度
    当Mg²⁺浓度与dNTPs总浓度相等时，保真度最高。保真度随着游离的二价阳离子浓度的增加而降低。
    反应pH值
    将反应的pH值降低3个单位可以使碱基替换量增加60倍。低pH值(<6.0)可导致自发性嘌呤遗失。
    DNA损伤
    DNA损伤可以在高温下发生，可能会增加突变的速度。一个常见的突变是胞嘧啶脱氨生成尿嘧啶。
· 引物序列中存在的A延伸
    过度循环
    在最终的PCR循环中，当DNA浓度增加时，错误率增加。总循环数应保持在最低限度，以生产出没有错误
    的目的PCR产物。

以下是常见的PCR artifacts：
引物二聚体
引物二聚体在扩增引物的3'端通过自互补形成。如果产物是在无模板反应(阴性对照)中产生，则怀疑是引物二聚体。为了避免引物二聚体，引物的3'端不应该有互补性。

嵌合PCR产物
嵌合PCR产物可能是由于模板不完全延伸造成的。换句话说，由于聚合酶过早终止而没有完全复制的单链模板可以退火为部分同源模板。这就产生了嵌合的PCR产物。为了减少嵌合体，使用尽可能少的PCR扩增循环。

PCR偏差
当PCR引物优先结合导致某些序列扩增效率高于其他序列时，PCR就会发生偏差。如果一个序列在一个循环内比另一个序列多扩增10%，那么在30个循环后，这个序列的扩增量将是另一个序列的17.4倍。为了减少PCR偏差，在变性和退火步骤之间使用高的升降温速度，并使用低的退火温度。应避免较长的延长时间（>180秒）。

PCR漂移
PCR漂移是由于PCR试剂相互作用的随机波动，特别是在模板浓度非常低的早期循环。在多重分析中可以观察到这种产物，不同引物之间的相互作用会导致灵敏度的降低。对这些情况要仔细分析，设计出合适的引物是很重要的。

· PCR产生的高分子量产物很难在琼脂糖凝胶中迁移
对这种产物没有很好的解释。大多数研究人员认为这是由于过度循环造成的，因为在PCR的后期，单链和双链分子都会聚集。这种单链分子的积累可以通过与引物竞争而产生杂双环。当PCR产物浓度较高时，后期的不完全变性会阻止DNA链分离，因此新形成的扩增子可能仍然与先前制作的模板结合。这个过程可以重复，在分子网络中捕获PCR产物。
高分子量拖尾的来源，其另一种解释是模板在初始PCR循环的部分延伸。当引物或单链DNA退火并从一个启动位点延伸，然后部分退火至其他同源片段时，跳跃的产物可产生部分延伸(见上文嵌合PCR产物)。部分延伸的分子可以作为新的引物，因为它们含有一个游离的3’- OH，并且可以产生结合初始启动位点和“跳跃”位点的嵌合分子。
最后，当使用粗提物模板进行PCR时，也可以生成这类产物。直接从动物或植物组织中扩增出来的产物会被困在细胞碎片中，从而阻止它们在凝胶中迁移。这一问题可以通过对扩增的PCR产物进行蛋白酶K消化来解决：
在整个50 μL的PCR反应中加入15 μL含有蛋白酶K的loading buffer。
或者
在将样品上样电泳之前，将1 μl含有蛋白酶K的缓冲液添加至4 μl PCR反应液中。

针对所有Takara Bio PCR酶
· 问题1：
引物不是特异性的
· 解决方案：
使用BLAST比对来确定引物的3’端是否有与目标位点以外的位点互补。必要时可重新设计引物或调整PCR条件。
· 问题2：
PCR反应条件不够严格
· 解决方案：
1. 按照2℃梯度增加退火温度
2. 使用touchdown PCR
3. 使用两步法的PCR操作流程
4. 减少PCR循环圈数
· 问题3：
模板加量过多
· 解决方案：
2-5倍稀释后添加，减少模板使用量

PrimeSTAR HS 和 PrimeSTAR Max DNA polymerases
· 问题：
退火时间过长
· 解决方案：
为了获得特异性扩增，在进行三步法PCR时，必须使用短的退火时间（5-15秒）

PrimeSTAR GXL DNA polymerases
· 问题：
引物Tm值不够理想
· 解决方案：
扩增1 kb以下的目的片段，请重新设计Tm值>55℃的引物，退火温度设定在60℃。如果引物Tm值<55℃，尝试设置5-10 sec/kb这样较短的延伸时间。

TaKaRa Ex Taq和TaKaRa LA Taq DNA polymerases
· 问题：
非特异性引物在低温下退火
· 解决方案：
TaKaRa Ex Taq 和TaKaRa LA Taq DNA polymerases的热启动版本可以改善其中一些引物的扩增结果。

SpeedSTAR HS DNA Polymerase
· 问题：
电泳检测时PCR产物条带拖尾
· 解决方案：
延伸时间过长可能导致拖尾。SpeedSTAR HS DNA Polymerase的延伸时间一般建议为10～20秒/kb。如果PCR产量低，可以尝试增加5圈循环圈数。

首先，使用阳性和阴性（无模板）对照来确定拖尾的来源。可以确定造成拖尾的原因是污染还是过度循环，或者是由引物设计不合理或PCR条件不理想产生的。 如果阴性对照为空白，则无污染。相反，需要优化PCR条件；在调整PCR条件时需要考虑以下因素：
· 减少模板添加量
· 提高退火温度
· 使用touchdown PCR
· 减少PCR循环圈数
· 重新设计引物
· 使用巢式引物
· 重新扩增PCR产物。（用枪头挑取一小块电泳胶，添加200 μl水后37°C孵育回收DNA。使用5 μl孵育液
   作为PCR模板进行重新扩增。）
如果阴性对照也出现拖尾，则存在污染。需要我们确定这种污染的来源。或许有必要更换一下PCR试剂，并对移液器和实验台清洁以去除污染（有关污染的更多信息，请参阅下面的问题）。

PCR污染主要有四种来源：
1. 最常见的污染源是来自以前扩增的PCR产物（被称为“carryover contamination”）。当在一段时间内重复
  产生大量PCR产物（10¹²）时，污染的可能性随之增加。
2. 另一个污染源是以前在实验室处理过的克隆DNA。
3. 样品间的污染也可能发生。这种污染源最有可能在扩增前需要广泛处理的样品中发现。
4. 减PCR反应也可能被环境中的外源性DNA污染，包括存在于实验室设备上和用于DNA提取和PCR试剂中的DNA。

为了避免PCR过程中的错误，我们建议使用高保真酶（参见PCR Enzyme的选择）。
此外，一定要避免以下情况：
1. 过度循环
过度循环PCR反应经常会出现：
· 以破坏DNA稳定性的方式改变反应的pH值。
· 增加PCR产物的量，从而降低聚合酶的效率，导致错误的发生
· 降低了dNTP的数量，从而增加由于不平衡的dNTP浓度而导致的碱基配对错误的可能性。（如果使用Takara
   Bio的PCR酶，dNTP浓度优化为200 nM；增加dNTP浓度会导致误掺入。）
· 引起单链和双链DNA的积累。
2. Mg²⁺浓度过高
Mg²⁺浓度范围为1-5 mM。使用高浓度的Mg²⁺可以提高产量，但也可能影响酶的校正活性。然而，Mg²⁺浓度应该始终高于dNTP浓度。
3. 模板DNA损伤
在分析或切胶回收PCR产物时，缩短紫外线照射时间。

需要。一般的PCR用引物5′末端都不带磷 (除非在引物合成时已特别标记)。使用这种引物进行PCR的PCR产物经末端平滑化后，与去磷酸的平滑末端载体连接之前，PCR产物必须进行5′末端磷酸化。

在通常情况下，首先须把PCR产物进行纯化后再进行限制酶的酶切反应。但如果只使用PCR反应液的一部分 (1～5 μl) 进行酶切反应时，可以不经纯化使用TaKaRa限制酶进行20 μl体系的酶切反应。

为保证各种PCR酶的使用效果，请务必将Buffer完全融解并充分混匀后使用。

PCR反应的关键环节：①模板核酸的制备；②引物的质量与特异性；③酶的质量；④PCR条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析检测。
一、 模板
a．模板中含有杂蛋白质，特别是染色体中的组蛋白。
b．模板中含有Taq酶抑制剂。
c．提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
d．模板核酸变性不彻底。
e．选择质量可靠的提取试剂。
f．靶序列变异。如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，导致PCR不能有效扩增。
二、 引物：引物的设计、引物质量是PCR扩增成败的关键。
a．引物设计不合理，如引物长度不够、引物之间形成二聚体等，需要重新设计引物。
b．合成高质量、高纯度级别的引物。
c．引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期4℃保存，导致引物降解失效。
三、 酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或活性降低而导致没有产物。
四、 PCR条件。
a．PCR扩增条件：变性对PCR扩增相当重要，如变性温度低、变性时间短都有可能出现扩增无产物；退火温度过低，可导致非特异性扩增而降低特异性扩增效率；退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。
b．Mg²⁺浓度：Mg²⁺浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高会降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败。
c．反应体系：通常进行PCR预实验采用的是小体系，正式实验如需扩大体系时，一定要重新摸索条件，否则容易出现扩增效果不理想或者失败。

PCR扩增出现的假阳性条带与目的序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高，产生的原因有以下几点：
1. 引物设计不合理
a．选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性序列。
b．靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。
2. 出现污染
a．整个基因组或大片段的交叉污染。
b．空气中的小片段核酸污染。

进行污染检测的时候，关键是做对照实验。
1．阳性对照：PCR反应都应设有PCR阳性对照，它是PCR反应是否成功、产物条带大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。 需要注意有以下方面：
a．阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性样品，添加量不要过多。
b．阳性对照对检测或扩增样品污染的可能性很大，因此操作的时候，PCR预混合液的配制和模板的填加一定要分区操作。
2．阴性对照：每次PCR实验务必做阴性对照，即在PCR试剂中不填加模板DNA或RNA，直接进行PCR扩增，从PCR扩增的结果判断试剂是否有污染。
3．重复性实验。
4．选择不同区域的引物进行PCR扩增，以检测污染是来源于引物还是其他试剂。

防止污染及消除污染的方法有以下几种：
1．合理分隔实验室：样品的处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开，实验室最好能划分为：
a．样品处理区
b．PCR反应预混液配制区
c．PCR循环扩增区
d．PCR产物鉴定区 注意：各实验用品及移液器应分区专用；实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA或RNA。
2．移液枪：由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入移液器或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。
3．PCR试剂：每次使用时要多加小心，避免带入污染。
4．Eppendorf管：应选择质量好的Eppendorf管。
5．防止操作人员污染：使用一次性手套、枪头及离心管等。
6．避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体离心至管底部，同时开管动作要轻，以防管内液体溅出。
7．适当的PCR循环次数。
8．设立适当的阳性对照和阴性对照实验。

特异性非常重要。20 mer左右的Primer，如果特异性高，扩增20 kb没有问题。
如果可能，根据以下原则制备引物：
1）长度在25-30 bases。
2）引物间最适退火温度相差2℃以内。
3）选择GC含量40-60%的引物。
4）避免引物形成发夹结构或引物二聚体，尤其是3’末端。
5）避免使用序列中含inosine的引物。

请在终浓度为0.1 μM～1.0 μM的范围内进行条件研讨。引物的浓度过低时，有时扩增量较小；而引物的浓度过高时，会产生非特异性带。通常当模板DNA的量较多或模板为复杂结构（High Complexity）时，引物浓度应低一些；而当模板DNA的量较少或模板结构不很复杂（Low Complexity；如质粒等）时，引物浓度应稍高一些。

50 μl的反应体系可使用2.5 U的TaKaRa LA Taq。但合适的用量也与模板DNA的量、DNA的结构、扩增片段的大小等有关。酶量过多时，易发生非特异性反应，电泳时出现Smear；酶量过少时，反应性能下降。

模板DNA的质量是LA PCR成功与否的重要因素。扩增超过10 kb的DNA片段时，用简单的方法 (例如Cell只经过加热处理或Protease处理) 调制的DNA作模板不太合适， 建议使用充分精制的完整的DNA (没有Nick等)。

可以。99℃、10 min处理后的噬菌体约10⁶～10⁷ pfu作为模板，至少可扩增8 kb的DNA片段。

· 对E. coli只进行热处理可扩增10 kb的DNA片段 (50 ml PCR反应液中37℃ Overnight culture in L-both使用2 μl)。
· Human细胞 (培养细胞) 如只经过热处理，可扩增数百bp；经过Protease处理、 热处理后的样品，最多可扩增1～2 kb。所以，如果要扩增长链DNA，建议使用经过充分精制的完整的DNA作模板。

可以。使用TaKaRa LA Taq 及TaKaRa Ex Taq 时的PCR产物产生A的Overhang，与使用TaKaRa Taq 时的PCR产物克隆于T-vector 的效率基本相同。

Long PCR成功的关键之一是设计30 mer以上的长引物，以增加引物的特异性。而长引物的Tm值一般较高，在进行PCR反应时，Annealing温度和Extension温度间的差距较小。当Annealing温度超过60℃时，Annealing温度 和Extension温度就可以设定在同一数值，此时进行2阶段温度PCR反应，效果颇佳。当使用20 mer左右的引物进行Long PCR时，进行3阶段温度PCR反应较好, 20 mer左右的引物也在诸多实验中成功地进行过Long PCR。