各种Nuclease的特性比较列表如下：
Endonuclease（核酸内切酶）种类：
S1 Nuclease，Mung Bean Nuclease，BAL 31 Nuclease（单链），Micrococcal Nuclease，Deoxyribonuclease I，Ribonuclease H
Exonuclease（核酸外切酶）种类：
Exonuclease I，Exonuclease III，BAL 31 Nuclease（双链）
S1 Nuclease |
Mung Bean Nuclease | Exonuclease I |
Exonuclease III |
|
反应特异性 |
Endonuclease |
Endonuclease ssDNA，ssRNA |
Exonuclease |
Exonuclease |
最终生成物 |
5’-P Mononucleotide |
5’-P Mononucleotide 5’-P Oligonucleotide |
5’-P Mononucleotide |
ssDNA |
分子量 |
32,000 |
39,000 | 52,140 |
28,000 |
最适pH |
4.5 |
5.0 | 9.5 |
8.0 |
金属离子 |
Zn2+ |
Zn2+ | Mg2+ |
Mg2+ |
BAL 31 Nuclease |
Deoxyribonuclease I | Micrococcal Nuclease |
Ribonuclease H |
|
反应特异性 |
Endonuclease ssDNA |
Endonuclease ssDNA，dsRNA |
Exonuclease |
RNA-DNA Hybrid特异的Endonuclease |
最终生成物 |
5’-P Mononucleotide |
5’-P Oligonucleotide | 3’-P Mononucleotide |
ssDNA |
分子量 |
73,000～83,000 |
31,000 | 16,800 |
21,000 |
最适pH |
8.1 |
7.0 |
9.2 |
8.0 |
金属离子 |
Ca2+，Mg2+ |
Ca2+，Mg2+ | Ca2+ |
Mg2+，Mn2+ |
各种核酸酶的使用注意事项如下：
1. Mung Bean Nuclease：
双链识别能力依赖于碱基序列，切点多为A↓pN及T（U）↓pN，特别是在A↓pN处完全分解，而对G及C的序列几乎不分解。
与S1 Nuclease不同，不能切断切口对侧的链。
2. BAL 31 Nuclease：
请通过预备实验探讨适合的反应条件，此时所要研讨的项目包括：酶量、盐浓度、反应温度（37～65℃）、DTT浓度（0.5～10 mM）。
a. 单链Endonuclease活性在反应温度从30℃降到20℃时，大约下降到1/10左右，而双链Exonuclease活性大约残留1/3左右。
b. Endonuclease活性不受盐浓度影响，但Exonuclease则是盐浓度越高活性越低。
c. Trimming活性的最适盐浓度为NaCl 200 mM左右，若低于此浓度有时表现Nicking活性。
d. 分解活性对碱基的依存性较高，由于GC rich领域（特别是Sma I site）不易被分解，在酶切时，有必要选择末端限制酶位点。
e. 反应中因各种酶活性的反应分配（Distributive）关系，对酶浓度有较大的依存，所以对稀释不表现线性关系。当酶反应速度过快时，与其降低酶量，不如降低反应温度。
f. 本酶需要Ca2+的存在，通过使用螯合剂可使其不可逆失活。在NaCl浓度为1 M左右时，该酶对于单链DNA表现出最大活性。相反对于双链DNA，其活性则随着盐浓度的增加而降低。当盐浓度在100 mM以下时，有时会发生随机分解。因此，建议在盐浓度200～600 mM的范围内进行反应。
g. 通过本酶产生的末端的平滑率只有10%左右，为了提高连接效率，建议通过T4 DNA Polymerase进行修复。
3. Exonuclease III：
a. 反应在37℃时受各种活性的分配影响（Distributive），但在23℃时，如果酶量充分，基本上能以一定的速度分解。
b. 该酶在性质上有这样一个特点：DNA即使具有3’突出末端，有时也因其末端及序列的不同而被作为底物降解。例如：
一个碱基突出型（Eam1105 I等）
二个碱基突出型（Pvu I、Sac II等）
三个碱基突出型（Sfi I等）
四个碱基突出型（Apa I被确认，Ban II及BstX I也有可能）
4. Micrococcal Nuclease：
本酶的活性严格依赖于Ca2+的存在，用EDTA或EGTA可以终止反应。
5. Deoxyribonuclease I：
a. 本酶最适pH值为中性附近，稳定pH值为5～6。
b. 80℃、10分钟热处理后，可使其不可逆失活。
一般认为，末端为GC时Mung Bean Nuclease易发生碱基残留，而S1与之相反易发生切入（Nibbling）现象，根据DNA末端的不同而区分使用为宜（末端富含GC时使用S1，但应注意反应时间，不要发生切入现象。除此之外使用MB）。但不管哪种酶，在反应后用T4 DNA Polymerase处理后，DNA末端平滑的效率都会提高。
Mung Bean Nuclease基本上不发生切入现象。请在10～50 U/μg DNA，25℃，15min的条件下进行反应。在30 U，37℃，10 min以上的条件下有时可能会发生非特异性分解。另外，在用Mung Bean Nuclease处理DNA之前使用Exo III时，在DNA上如有切口，Exo III将从切口处作用。因此，需要确认是否是无切口的完好的DNA。
由于BAL 31 Nuclease是海洋细菌由来的酶，即使在高盐浓度下也能充分地显示活性。分别在60 mM、200 mM、600 mM NaCl下比较Exonuclesae活性，几乎没有差别。60 mM与600 mM相比，也只是在60 mM条件下的酶活性高2～3倍左右。由于在60 mM NaCl条件下，容易因Nicking活性而发生链内裂解，因此，不适于使用低盐浓度。而在600 mM NaCl条件下分解速度适当，在使用上完全没有问题。
BAL 31 Nuclease对Nick（切口）作用，但程度较低。
使用例
DNA的片段化
1. 在微量离心管中配制下列反应液。
| DNA | 100 | μg | |
| 10×Micrococcal Nuclease | 5 | μl | |
| Micrococcal Nuclease | 2 | U | |
| dH2O | Up to 50 | μl |
2. 37℃反应数分钟（通过预实验确定具体反应时间）。
3. 加入5 μl的200 mM EGTA（或EDTA）停止反应。
4. 加入5 μl（1/10量）的3 M NaOAC（pH5.2）。
5. 加入125 μl（2.5倍量）的冷无水乙醇，-20℃放置30～60分钟。
6. 离心回收沉淀，用70％的冷乙醇清洗沉淀，真空干燥。
使用BAL 31 Nuclease时，降低反应温度（20℃时大约为30℃时的1/3活性），或Exonulease III和S1 Nuclease组合使用。
Exo III也作用于Nick。用限制酶切断DNA时，如果酶过量或使之长时间反应时，由于Star活性有时会使DNA产生切口。
通常使用Recombinant DNase I (RNase-free)来分解体外转录后的模板DNA和去除RNA中的基因组DNA，反应后都要经过苯酚抽提。
Recombinant DNase I (RNase-free)的RNase Free是相对的，如果不是必要的话，可以不去除RNA中的gDNA，而是通过设计引物来避免扩增gDNA模板，同时做负对照（不加反转录酶）来检验实验结果。如果必须去除gDNA，一定要使用RNase Free 的DNase I。
使用DNA Topoisomerase I要注意以下问题：
1. pBR322 DNA和φX174 DNA的RF I（超螺旋分子）用DNA Topoisomerase I反应后电泳，胶中含溴乙锭（EtBr）时，反应前后DNA带的位置不发生变化。这是因为由DNA Topoisomerase I作用而转换为松散型的DNA受EtBr的影响，再次变为超螺旋状态。因此，使用Topoisomerase I反应后，一般使用不含EtBr的琼脂糖凝胶电泳，电泳终了后再用EtBr染色。
2. 如果在10×添附Buffer中直接加入0.1%小牛血清白蛋白溶液，会产生大量的白色沉淀。因此，在反应液调制时需按以下顺序添加试剂：
dH2O→10×反应缓冲液→0.1% BSA→底物DNA
页面更新：2020-04-27 14:04:59
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