没有问题。附带的缓冲液是进行活性测定的缓冲液，选择了与原来的基本缓冲液组份相近的缓冲液，未必是活性最高的缓冲液。使用附带的缓冲液以外的缓冲液进行反应，也是没有问题的，但数字上加（）的缓冲液，是易受Star活性等影响的缓冲液，应避免使用。
为了方便实验操作，Takara采用了通用缓冲液（Universal Buffer）的限制酶活性表示方法，同时也满足双酶切反应（Double Digestion）的要求。本公司的限制酶尽可能地配备Universal Buffer。例如：L、M、H Buffer等。对一些常用的限制酶，还对同步双酶切反应条件作了严格的研讨，其结果见Double Digestion（双酶切反应）时Universal Buffer（通用缓冲液）的使用表，请参考使用。而对一些在5种Universal Buffer中相对活性都不太高的限制酶，附带其Basal Buffer。但请注意，因为Basal Buffer为各种限制酶的最适Buffer，其组成也根据酶种类的不同而不一样。
可以考虑以下几种情况：
■ 1. 底物DNA上没有该限制酶的识别、切断位点。特别是一些经过重组等处理的DNA，碱基易发生缺失、变化等。
■ 2. 限制酶识别位点上的A或C被甲基化。部分限制酶对识别位点中的碱基是否被甲基化比较敏感，从而无法切断该位点。有关甲基化对限制酶的酶切反应的影响，请参考甲基化对限制酶活性影响的表格，其中做了详细说明。
■ 3. 底物不纯。如果底物DNA中含有限制酶阻害物质，会影响限制酶的酶切作用。在此种情况下，底物DNA须重新进行纯化。
■ 4. 限制酶的识别、切断位点在底物DNA的高级构造中所处的位置，对酶切反应也有一定的影响。
■ 5. PCR引物的酶切位点前没有保护碱基或引物合成有误，致使没有正确的酶切位点存在。PCR产物酶切前尽量进行精制以更换Buffer，避免PCR产物中带入的其它物质影响酶切反应。据报道，通常PCR产物的添加量占总反应体积25%以下没有问题。
■ 6. 不同公司的酶和Buffer不要交叉使用，否则可能会影响酶切效果。
不稀释为好，Takara的限制酶都根据最佳反应体系配制了浓度。酶制品稀释时，酶浓度和活性之间不呈直线对应关系，酶浓度越稀，相对活性越低，并且越不稳定，有时便会出现底物DNA不能切断之现象。
一般情况下，从大多数的大肠杆菌中提取的DNA，几乎都存在被甲基化的现象，其相对应识别序列的受甲基化影响的限制酶即切不开该酶切位点。而只有在转化时选用了甲基化酶欠损的大肠杆菌作为宿主，提取的DNA才不会被甲基化。在实际操作中，如果使用受甲基化酶影响的限制酶对从一般的大肠杆菌中提取的DNA进行酶切反应，而没切开，或者对测序结果有酶切位点的片段，切不开，其酶切位点被甲基化的可能性就比较大，这时就要选用不受甲基化影响的限制酶进行酶切。
一种方法是，选用不受dam、dcm甲基化影响的限制酶进行酶切反应。例如Sau3A I、Mbo I具有相同的酶切位点，但Mbo I受dam methylase的影响，而Sau3A I不受dam methylase的影响。另外一种方法是，使用dam、dcm甲基化酶欠损的宿主菌（例如GM33、JM110）进行DNA的转化和制备。还可以使用PCR方法对该DNA进行扩增，然后再进行酶切。
由于底物DNA的不同，其含有的酶切位点的摩尔浓度不同，空间结构也不相同，这些，都会对酶切反应的速度产生影响，所以，相同的酶量，不一定能将不同的底物切开。
各种限制酶，所需要的酶切位点的保护碱基的数量不同。一般情况下，在酶切位点以外多出3个碱基，即可以满足几乎所有限制酶的酶切要求。
通常情况下，来自于哺乳类生物的基因组DNA中的CG序列，被CG methylase甲基化，形成5mCG。另外，由于生物学实验操作中被普遍使用的大肠杆菌（JM109、HB101等）几乎都含有dam methylase和dcm methylase，从这些宿主中提取的质粒DNA的GATC、CCWGG序列被甲基化，分别形成G6mATC、C5mCWGG。受甲基化影响的限制酶切不断其识别序列中被甲基化的DNA。所以，用于反应的DNA，会因为来源不同而出现切不开的现象。因此，在反应之前，一定要对DNA被甲基化的情况和所使用的限制酶受甲基化影响情况进行确认。
限制酶名称（）里记载的是该限制酶的同裂酶（Isoschizomer）。具有相同的识别序列的限制酶互称为同裂酶。Sau3A I和Mbo I是具有相同识别序列和切断位置的同裂酶，Mbo I由于受dam methylase的影响，不能够切断来自于一般大肠杆菌的DNA。而Sau3A I不受dam methylase的影响，可以切断一般大肠杆菌由来的DNA。有些同裂酶切断位置不一样，即虽然识别序列一样，但切断位置不同，使用时必须注意。另外，即使是切断位置相同的同裂酶，其受甲基化的影响情况有时也不一样。
请参看《Double Digestion（双酶切反应）时的Universal Buffer（通用缓冲液）的使用 表》，选择双酶切反应时的通用缓冲液。Takara公司从1979年开始生产限制酶以来，做了大量的基础实验，也积累了很多经验，同步双酶切通用缓冲液表格中所推荐的双酶切Buffer完全是依据具体实验结果得到的。Takara公司为了方便限制酶的统一使用，采用了通用缓冲液（Universal Buffer）系统，并列出了各种限制酶在各种通用缓冲液中的相对活性。如果两种酶在《Double Digestion（双酶切反应）时的Universal Buffer（通用缓冲液）的使用表》中没有找到同步双酶切的通用缓冲液，我们可以在《用Universal Buffer和Basal Buffer进行限制酶活性表示》表中挑选一种通用缓冲液进行双酶切反应，其条件是：两种酶在这种通用缓冲液中的相对活性都比较高（60%以上）。如果没有找到同步双酶切的通用缓冲液，通常要进行分步酶切，即先做一种酶切，乙醇沉淀纯化后，再做另一种酶切反应。
底物DNA或酶切试剂中混有DNase，在一定的温度或缓冲液的作用下，激发DNase发挥作用，将底物DNA降解。可以使用其他限制酶酶切底物DNA，也可以使用此酶切其他底物DNA，来验证酶和底物DNA是否有问题。如果质粒酶切出现此情况，首先将质粒做乙醇沉淀再酶切。
乙醇沉淀的方法如下：
■ 1. 加入1/10体积的3 M CH3COONa（pH5.2），混匀。
■ 2. 加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20℃放置30～60分钟。
■ 3. 12,000 rpm，4℃离心10 min，回收沉淀。
■ 4. 用1 ml 70%的预冷乙醇清洗沉淀，12,000 rpm，4℃离心10 min，除去上清，真空或室温干燥沉淀，注意不要干燥过度。
■ 5. 沉淀用灭菌蒸馏水或TE溶解，进行后续反应。
简并碱基的种类表示如下：
M：A or C R：A or C S：C or G
K：G or T Y：C or T????????????H：A or C or T
N：A or C or G or T? W：A or T D：A or G or T
以上的纯化方式都可以对酶切产物进行纯化。但是一般苯酚/氯仿抽提和切胶回收的损失比较大。分步酶切的中间产物可以使用乙醇沉淀和片段回收试剂盒（在允许纯化的片段长度范围内使用）进行纯化，这样操作可以减少损失。
① 引起Star活性的原因：
■ 1. 较高的甘油浓度（>5% v/v）。
■ 2. 酶与底物DNA比例过高（不同的酶情况不同，通常为>100 U/μg）。
■ 3. 低盐浓度（<25 mM）。
■ 4. 高pH值（pH>8.0）。
■ 5. 存在有机溶剂（如DMSO、乙醇、乙烯乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺等）。
■ 6. 用其他二价离子替代镁离子（如Mn2+，Cu2+，Co2+，Zn2+等）。
Star活性是内切酶的一种普遍现象，但是大多数可以控制，正常情况下使用宝生物提供的缓冲液就不会出现Star活性。
② 抑制Star活性的方法：
■ 1. 尽量使用较少的酶进行完全消化反应。这样可以避免过度消化以及过高的甘油浓度。
■ 2. 尽量避免有机溶剂（如制备DNA时引入的乙醇）的污染。
■ 3. 将离子浓度提高到100～150 mM（若酶活性不受离子强度影响）。
■ 4. 将反应缓冲液的pH值降到7.0。
■ 5. 二价离子使用Mg2+。
通常使用高浓度限制酶酶切gDNA等高浓度DNA样品，这样可以避免在反应液中加入过量的甘油，从而有效防止Star活性产生。此外，对于需要大量酶的脉冲场电泳，使用高浓度限制酶更方便。但需要注意，当反应液中底物DNA浓度较低时，加入适当活性单位的高浓度限制酶，操作会很困难，这种情况下推荐使用普通浓度的限制酶制品。 两种浓度限制酶在保存稳定性上是一致的。
每种限制酶、DNA底物的标准使用量，请参考说明书中“一般反应体系”内容。
限制酶的活性单位是按照反应1小时定义的，通常建议反应时间从1小时至几小时。反应中使用的标准酶量是反应体系的1/20体积量。如果要增加酶的使用量，请控制在反应体系的1/10体积量以下。限制酶溶液中的甘油如果过量（5%以上）引入到反应液中，会影响限制酶识别DNA序列，从而导致不正确的序列识别，产生非特异性酶切。如果使用的酶量(U)相对于DNA底物不足，则需要更长的酶切反应时间。另外，限制酶的活性受到识别位点前后序列的影响，酶切难易程度不同。
限制酶反应后立即进行电泳时，只需添加10×Loading Buffer，不需要进行限制酶的失活处理。但是，限制酶中有稳定性高的酶，如果直接进行后续反应残留的酶活性可能会对反应产生影响。很多限制酶可以通过加热失活，但是有的酶经70°C加热处理也不能完全失活。对于这样的酶，请使用苯酚进行完全失活处理。关于失活处理后残存活性的数据，请参考以下网站内容。
各种失活处理后限制酶的残存活性
酶切反应中，Mg离子是必需的。过量的EDTA会螯合反应液中的金属离子，阻碍酶切反应。核酸制备一般含有1 mM的EDTA。反应液中加入1/10左右体积量的DNA底物时，对反应没有影响。
可以使用能够切断腺嘌呤甲基化GmA↓TC的Dpn I (Code No. 1235A/B)。该酶能切断甲基化的GmATC，但不能切断未被甲基化的GATC。该酶能够切断来源于常用大肠杆菌(dam+)的DNA，不能切断PCR产物，因此可用于去除PCR产物中的质粒模板。
QuickCut限制酶不建议与普通限制酶同时使用，进行同步双酶切。如果需要进行双酶切，可以考虑分步酶切，一种酶切结束后经过乙醇沉淀再使用另一种酶进行酶切。
普通限制酶不建议搭配QuickCut Buffer使用。
使用QuickCut限制酶进行双酶切时，两种酶的总加量不超过反应体系的1/10。
如果各酶的反应温度不同，建议按低温到高温的顺序加入相应的QuickCut限制酶进行分步酶切反应。
QuickCut限制酶酶切时间不宜过长。如果需要延长酶切时间，建议时间不要超过“不产生Star Activity的时间”，具体信息可以参考制品说明书。
不建议缩小酶切反应体系，酶切体系过小可能会影响酶切效果。
页面更新：2019-12-09 16:09:06
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