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pUC18/19/118/119载体多克隆位点处的限制酶双酶切效果
在基因工程实验中，经常要对DNA片段进行2种限制酶的酶切反应。但经过实验验证，对在DNA片段上相邻或相近的两个限制酶切位点进行双酶切反应时，往往达不到预期的效果。例如，对pUC18载体多克隆位点处的Kpn I 和Sma I 进行双酶切时，酶切反应难以进行。而针对有些酶切位点进行双酶切时，酶切效果与酶切反应所用限制酶的顺序还有关系。例如，要对Sac I 和Kpn I 这两个酶切位点进行双酶切时，如果先用Sac I 进行酶切，然后再用Kpn I 进行酶切，双酶切反应则无法进行。但是如果先用Kpn I 进行酶切，然后再用Sac I 进行酶切，双酶切反应则可以进行。造成这些结果的原因是因为进行限制酶的双酶切反应时，由于受到酶切位点周围碱基数量的影响，从而影响了酶切效果。
本公司对pUC18/19/118/119载体多克隆位点处的限制酶进行双酶切时的效果进行了实验验证，结果见表1和表2。表1是用两种限制酶进行分步酶切时的结果，表2是用两种限制酶进行同步酶切时的结果。
为了保证实验的顺利进行，对载体多克隆位点上的限制酶进行双酶切时，应该考虑各限制酶之间的位置关系。建议按照酶切效率高的酶切顺序进行酶切。
下表中记号：“O”表示限制酶酶切效果较好；“△”表示限制酶的酶切效果不太好；“X”表示限制酶酶切效果很差。
 
表1 分步酶切效果
Second
EcoR I Sac I Kpn I Sma I BamH I Xba I Sal I Acc I Hinc II Pst I Sse8387 I Sph I Hind III
First EcoR I ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
Sac I ○ × ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
Kpn I ○ ○ × ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
Sma I ○ ○ × ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
BamH I ○ ○ ○ × × ○ × ○ ○ ○ ○ ○
Xba I ○ ○ ○ ○ ○ × × × ○ ○ ○ ○
Sal I ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
Acc I ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
Hinc II ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
Pst I ○ ○ ○ ○ ○ ○ × × × ○ ○
Sse8387 I ○ ○ ○ ○ ○ ○ × × × ○ ○
Sph I ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ × ○ × ○ ×
Hind III ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
 
表2 同步酶切效果
Simultaneously
EcoR I Sac I Kpn I Sma I BamH I Xba I Sal I Acc I Hinc II Pst I Sse8387 I Sph I Hind III
Simulta-neously EcoR I △ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
Sac I × ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
Kpn I × ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
Sma I △ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
BamH I × ○ × ○ ○ ○ ○ ○
Xba I △ △ △ ○ ○ ○ ○
Sal I × × ○ ○
Acc I × △ ○ ○
Hinc II △ △ ○ ○
Pst I △ ○
Sse8387 I △ ○
Sph I ×
Hind III
注：
1. 对相邻酶切位点的限制酶进行双酶切反应时，同时加入限制酶进行双酶切反应的切断效果都不太理想，建议按先后顺序加入相应的限制酶进行酶切反应。
2. 使用EcoR I进行酶切反应时，酶切体系为20 μl，将酶的添加量控制在10 U左右，反应时间控制在2小时左右，双酶切效果较好。
pUC18 multi cloning site

页面更新：2017-04-10 15:55:46


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