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pUC18/19/118/119载体多克隆位点处的限制酶双酶切效果

在基因工程实验中,经常要对DNA片段进行2种限制酶的酶切反应。但经过实验验证,对在DNA片段上相邻或相近的两个限制酶切位点进行双酶切反应时,往往达不到预期的效果。例如,对pUC18载体多克隆位点处的Kpn I 和Sma I 进行双酶切时,酶切反应难以进行。而针对有些酶切位点进行双酶切时,酶切效果与酶切反应所用限制酶的顺序还有关系。例如,要对Sac I 和Kpn I 这两个酶切位点进行双酶切时,如果先用Sac I 进行酶切,然后再用Kpn I 进行酶切,双酶切反应则无法进行。但是如果先用Kpn I 进行酶切,然后再用Sac I 进行酶切,双酶切反应则可以进行。造成这些结果的原因是因为进行限制酶的双酶切反应时,由于受到酶切位点周围碱基数量的影响,从而影响了酶切效果。
本公司对pUC18/19/118/119载体多克隆位点处的限制酶进行双酶切时的效果进行了实验验证,结果见表1和表2。表1是用两种限制酶进行分步酶切时的结果,表2是用两种限制酶进行同步酶切时的结果。
为了保证实验的顺利进行,对载体多克隆位点上的限制酶进行双酶切时,应该考虑各限制酶之间的位置关系。建议按照酶切效率高的酶切顺序进行酶切。
下表中记号:“O”表示限制酶酶切效果较好;“△”表示限制酶的酶切效果不太好;“X”表示限制酶酶切效果很差。
 
表1 分步酶切效果
Second
EcoR I Sac I Kpn I Sma I BamH I Xba I Sal I Acc I Hinc II Pst I Sse8387 I Sph I Hind III
First EcoR I
Sac I ×
Kpn I ×
Sma I ×
BamH I × × ×
Xba I × × ×
Sal I
Acc I
Hinc II
Pst I × × ×
Sse8387 I × × ×
Sph I × × ×
Hind III
 
表2 同步酶切效果
Simultaneously
EcoR I Sac I Kpn I Sma I BamH I Xba I Sal I Acc I Hinc II Pst I Sse8387 I Sph I Hind III
Simulta-neously EcoR I
Sac I ×
Kpn I ×
Sma I
BamH I × ×
Xba I
Sal I × ×
Acc I ×
Hinc II
Pst I
Sse8387 I
Sph I ×
Hind III
注:
1. 对相邻酶切位点的限制酶进行双酶切反应时,同时加入限制酶进行双酶切反应的切断效果都不太理想,建议按先后顺序加入相应的限制酶进行酶切反应。
2. 使用EcoR I进行酶切反应时,酶切体系为20 μl,将酶的添加量控制在10 U左右,反应时间控制在2小时左右,双酶切效果较好。
pUC18 multi cloning site