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Multipoints Mutagenesis Kit
品牌 Code No. 包装量 价格 说明书 数量
Takara R407 20 次 3,867 元
 
■ 制品内容 (20 次量)
T4 Polynucleotide Kinase (10 U/μl) 40 μl
10 × Reaction Buffer*1 40 μl
ATP (10 mM) 48 μl
10 × Annealing Buffer 40 μl
10 × Extension Buffer 60 μl
T4 DNA Ligase (60 U/μl) 20 μl
T4 DNA Polymerase (1 U/μl) 20 μl
PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2.5 U/μl) 10 μl
5 × PrimeSTAR Buffer (Mg2+ plus) 200 μl
dNTP Mixture (2.5 mM each) 80 μl
Control Plasmid (50 fmol/μl) 20 μl
Control Primer Mix (12.5 pmol/μl each) 20 μl
Control Anchor F (8 pmol/μl) 5 μl
Anchor F1 (8 pmol/μl)*2 20 μl
Anchor R1 (8 pmol/μl)*2 25 μl
ETail F (10 pmol/μl) 25 μl
ETail R (10 pmol/μl) 25 μl
Ligation Solution I 100 μl
 
*1 10 × Reaction Buffer于-20℃保存时会有白色浑浊出现,溶解后不影响反应。
*2 Anchor F1与 Anchor R1是基于pUC系列载体、pBluescript系列载体设计的锚定引物。Anchor F1的3′端和Anchor R1的5′端与上述系列载体的多克隆位点两侧序列完全一致;Anchor F1的5′端与ETail F序列完全相同,Anchor R1的3′端与ETail R序列完全互补。当要突变的DNA片段克隆于上述系列载体中时,锚定引物可以直接使用Anchor F1和Anchor R1。
 
■ 制品说明
本试剂盒是利用一对设计特殊的锚定引物 (Anchor Primer) 及几条定点突变引物对DNA多个不同位点同时进行定点突变的试剂盒。锚定引物“尾巴”上的特异性序列是与大多数基因都不相匹配的,因此保证了PCR扩增的特异性。本试剂盒的主要原理是:设计合成同一方向的锚定引物及定点突变引物,将锚定引物及定点突变引物用T4 Polynucleotide Kinase磷酸化后与模板质粒DNA进行退火,再使用T4 DNA Polymerase和T4 DNA Ligase进行延伸和连接形成突变单链,然后使用锚定引物“尾巴”上的特异性引物 (ETail F/ETail R) 和高保真DNA聚合酶PrimeSTAR对突变单链进行PCR扩增,再将获得的双链PCR产物克隆回原载体中,即可达到实验目的,获得目的突变体。
本试剂盒操作快速简单,只需一天时间便可以完成整个突变操作。本试剂盒尤其适用于插入片段长度在1.0 kb以下的多位点基因突变实验,对于1.0 kb以上的DNA片段的多位点基因突变,由于引物退火的不完全、PCR扩增中可能引入新的突变点等原因,可能降低实验成功率。本公司曾经使用本试剂盒,成功进行了1.5 kb DNA片段的多位点基因突变实验。
本试剂盒中的Anchor F1和Anchor R1引物可供克隆于pUC系列载体或pBluescript系列载体中的DNA片段的多位点基因突变实验,使用方便。使用试剂盒中的Control Plasmid及各种Control实验用引物可进行Control实验。
 
■ 保存
-20℃。
 
■ 引物设计说明
1. Kit中的Anchor F1与Anchor R1是基于pUC系列载体、pBluescript系列载体设计的锚定引物。当要突变的DNA片段克隆于上述系列载体中时,锚定引物可以直接使用Anchor F1和Anchor R1。
2. 当要突变的DNA片段克隆于其他载体中时,则需要设计锚定引物。上游锚定引物Anchor F的3′端和下游锚定引物Anchor R的5′端应与载体序列完全一致;Anchor F的5′端应与ETail F序列完全相同 (见下述【各种引物序列】表中Anchor F1的阴影部分),Anchor R的3′端应与ETail R序列完全互补 (见下述【各种引物序列】表中Anchor R1的阴影部分)。这样在实施PCR扩增时可以直接使用Kit中提供的ETail F和ETail R引物进行PCR扩增。
3. 所有锚定引物及定点突变用引物必须为同一方向,在进行Annealing、Extension、Ligation 时必须形成一条同一方向的突变单链作为靶序列,可以用于PCR扩增 (原理见图1)。
4. 引物长度应在25-50 nt之间,Tm≥75℃,引物长度最好不要超过50 nt,否则可能形成二级结构而影响定点突变效率。定点突变引物间最好有较为相近的Tm值,Tm值的计算公式如下:
    Tm=81.5+41×GC数量/N-675/N-突变碱基数/N×100
    其中N代表引物的长度。
5. 突变点最好设计在引物的中间,保证突变点两侧至少有10-15个碱基能与模板完全互补,引物的3′端应以G或C结尾。
6. 引物之间可以相邻或者有一定的间距 (目前尚未发现引物间的距离对多位点定点突变效率有影响)。
7. 为了保证引物质量,引物应进行PAGE纯化。
【试剂盒中的各种引物序列】
引物名称 引物序列 (5′→3′) 长度(nt)
  Anchor F1
  ACAGCAAAAGCCCGAGCGACCTTC CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC
48
  Anchor R1
  CCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTC CGGCTAAGGCACGCGCCACTTTT
47
    Control
  ACAGCAAAAGCCCGAGCGACCTTC GTAAGCGGATGCCGGGAGCAGAC
47
Control Primer Mix   CATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCG
31
  CGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCG
30
  TGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC
31
  GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAG
32
    ETail F   ACAGCAAAAGCCCGAGCGACCTTC
24
    ETail R   AAAAGTGGCGCGTGCCTTAGCCG
23
    
试剂盒原理
试剂盒原理见下图,简单操作步骤如下:
1. 设计锚定引物 (Anchor F、Anchor R) 以及定点突变用引物 (mt1、mt2……)。
2. 将Anchor F与Anchor R的混合物以及定点突变用引物 (mt1、mt2……) 混合物分别进行5′末端磷酸化。
3. 将5′末端磷酸化引物与原始质粒模板进行退火、延伸、连接反应,形成新的突变单链。
4. 用ETail F与ETail R对突变单链进行PCR扩增,获得突变双链DNA片段。
5. 突变双链DNA片段经酶切、凝胶回收后克隆于目的载体中。
6. 筛选阳性克隆,进行DNA测序,获得突变体。
 
 
 

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